前言
結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是胃腸道中常見的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，隨著癌腫的增大而表現(xiàn)排便習慣改變、便血、腹瀉腹瀉與便秘交替、局部腹痛等癥狀，晚期則表現(xiàn)貧血、體重減輕等全身癥狀。其發(fā)病率和病死率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌。近20年來，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢，嚴重危害人類健康， 故結直腸癌研究逐步成為近年來醫(yī)學研究的熱點之一，由此引發(fā)的各類動物模型的研究備受關注。
誘發(fā)性腫瘤動物模型制作方法相對簡單，重復性好，可以在較短時間內大量復制，而且基本模擬癌變的過程，因此，在實驗中應用較廣。但是，由于誘發(fā)性腫瘤實驗因存在環(huán)保問題而需防護設施，實驗條件要求較高。目前，建立直結腸癌誘發(fā)模型最常用的試劑是二甲基肼(dimethylhydrazine,DMH)和其代謝產(chǎn)物氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)，由于AOM相比DMH具有致癌作用穩(wěn)定、高效的特點，現(xiàn)正被越來越多的研究者采用。另外，隨著近年來研究顯示長期反復的炎癥性腸病(IBD)可以誘發(fā)直結腸癌，目前也采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)聯(lián)合AOM聯(lián)合制備炎癥相關性直結腸癌模型。
部分造模方法
使用動物：小鼠
【造模機制】：
1.DMH法 DMH本身并不致癌，須經(jīng)氧化脫烷基才具有致癌作用。DMH在肝細胞內質網(wǎng)被氧化成甲基氧化偶氮甲醇，與β－葡萄糖醛酸結合，一部分經(jīng)尿排出，一部分隨膽汁進入腸腔，在腸道細菌和腸黏膜上皮β－葡萄糖苷酸酶的作用下，甲基氧化偶氮甲醇重新游離，成為腸道終末致癌物并最終引起結直腸上皮癌變。
2.AOM法 AOM是DMH在肝臟的代謝產(chǎn)物，作用過程與DMH相似，它通過DNA烷化，促進堿基的錯誤配對而致癌。這兩種化學致癌物都可以誘發(fā)降結腸腫瘤，組織學表現(xiàn)類似人類散發(fā)性結腸癌。由于AOM相比DMH具有致癌作用穩(wěn)定、高效的特點，現(xiàn)正被越來越多的研究者采用。
3.AOM聯(lián)合DSS法 DSS是人工合成的一種硫酸多糖，將DSS溶解于水給敏感種系的小鼠或大鼠飲用，可引起以血便、潰瘍和粒細胞浸潤為特征的結腸炎癥，其病理改變接近人類潰瘍性結腸炎。DSS腸炎的發(fā)生可能與其影響DNA合成、抑制上皮細胞增生、破壞腸黏膜屏障、巨噬細胞功能障礙及腸道菌群失調等有關。研究發(fā)現(xiàn)，DSS所導致的炎癥以Th1/Th2細胞功能失調為特征，造成急性腸炎，經(jīng)過多個循環(huán)喂養(yǎng)動物也可產(chǎn)生慢性腸炎，并伴有一定的腸癌發(fā)生率。加之AOM自身對腸道的影響，兩者聯(lián)合可以誘發(fā)穩(wěn)定的炎癥性腸癌。
【造模方法】：
1.DMH法 選取4月齡雄性Wistar大鼠，將DMH用生理鹽水配制成濃度為4mg/ml的溶液，用1mol/L NaHCO3溶液或0.1mol/L NaOH溶液調pH為6.5，用0.22µm微孔濾器過濾除菌后備用。該濃度注射液腹腔注射，每次劑量21mg/kg，每周1次，連續(xù)20周。
2.AOM法 生理鹽水配制成濃度為1.25g/L溶液，選用6周齡雌性ICR小鼠，10mg/kg體重每周一次，腹腔注射，連續(xù)應用4周，觀察時間選擇實驗第36周，以腫瘤發(fā)生為觀察終點。
3.AOM/DSS法 選用雌性ICR、C57BL/6J或Balb/c小鼠均可。通常選用相對分子質量為40 000的DSS。第1天小鼠腹腔注射7.5~12.5mg/ kg AOM, 1周后飼喂(1%~3%)DSS1周，之后改為正常飲水14天為一個循環(huán)，共循環(huán)3次，稱之為“四步法”。“兩步法”與前者的區(qū)別在于將3次循環(huán)的DSS處理以后不做特殊處理縮短為單次循環(huán)，共兩步完成。四步法較兩步法加速了腫瘤的生成，詳細步驟如圖7-5所示。
圖7-5 AOM/DSS模型誘導方法
注：A.四步法；B.二步法。1：表示1周后飼喂DSS飲用水；2：表示即時飼喂DSS
【模型特點】：
1.DMH法 ①最后一次給藥后1~4周后處死動物，直結腸癌誘發(fā)率達到81%~100%，誘發(fā)的腫瘤均為惡性腫瘤，絕大多數(shù)為腺癌。②誘癌過程中，大鼠腸黏膜上皮依次出現(xiàn)輕、中、重度不典型增生，腺瘤、腺癌。表現(xiàn)出腸黏膜表面粗糙、皺褶變粗而不規(guī)則，可見單發(fā)或多發(fā)結節(jié)，有的帶蒂，直徑2~12mm不等。結節(jié)數(shù)目可多達20~30個，有的相互融合成巨塊，結節(jié)分布于直腸遠端及近肛門處。
2.AOM法 ①連續(xù)4周腹腔注射氧化偶氮甲烷10mg/kg為最佳的給藥劑量，此最佳劑量與動物的飼養(yǎng)環(huán)境無關，劑量過高會導致動物死亡率升高，劑量過低會導致癌癥程度較輕，不同的致癌劑最佳劑量取決于實驗動物遺傳背景和給藥方式。②每周腹腔注射氧化偶氮甲烷10mg/kg，連續(xù)4周，在第24周發(fā)生結腸癌的概率為100%。③不同遺傳背景小鼠對AOM的敏感程度不同，敏感性由強到弱的順序為：BALB/C小鼠與ICR小鼠有相同的作用，對氧化偶氮甲烷最敏感，C57BL/6N小鼠其次。④AOM誘導小鼠大腸癌的發(fā)生是一個長期的多階段的過程，與人類大腸癌發(fā)生過程中細胞動力學病理組織學和分子特征方面的變化特點非常相似。
3.AOM/DSS法 采用腹腔注射AOM(10mg/kg)和飼喂2%DSS飲水處理雄性ICR小鼠后，可觀察到炎癥導致腫瘤形成不同時期的病理學改變。第3周有2/5的小鼠出現(xiàn)結腸管狀腺瘤，第4周有2/5小鼠發(fā)生腺癌。此后，隨著時間推移，腫瘤發(fā)生率逐漸增加，第6周100％小鼠發(fā)生腺癌。所有時間點都可觀察到結腸不典型性增生。AOM/DSS模 型通過結腸黏膜的炎癥和不典型性增生使腸黏膜受損，促進腫瘤產(chǎn)生，伴有K-Ras和β-catenin基因突變、錯配修復基因缺失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性改變。
【模型評估和應用】：
1.CRC制備成功的概率主要取決于給藥的劑量、頻率、途徑、待續(xù)時間以及性別、周齡、遺傳背景等，同時腸道菌群、飲食、免疫狀態(tài)等可通過干擾致癌劑代謝來影響局部有效濃度。
2.DMH法和AOM法 致癌效果佳，器官選擇性好，腫瘤的發(fā)生部位、組織學類型以及腫瘤的發(fā)生過程均與人類直腸癌十分相似，可以較好地模擬人體直腸癌發(fā)生發(fā)展的實驗研究，只是缺少人結直腸癌的前期腺瘤和后期易轉移的特征。模型制備方法簡單，成模時間短，成瘤率高。
3.AOM/DSS模型 該模型是建立在炎癥基礎上重要的結腸癌模型之一，在致癌劑和致炎劑協(xié)同作用下模擬人類CRC的發(fā)生發(fā)展過程。利用該模型，結合實驗動物的各種基因修飾，研究人員對炎癥相關性癌癥癌變機制進行了系統(tǒng)研究，尤其在分子機制、腫瘤微環(huán)境和藥物研究較多，目前應用該模型涉及腫瘤干細胞的研究匱乏，有待科研工作者進一步探索。由于AOM/DSS模型鮮見抑癌基因APC和p53突變，CRC發(fā)生遠處轉移傾向低，而且患病后小鼠壽命縮短，故不適合用于腫瘤侵襲相關研究。
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