前言
肺間質(zhì)纖維化(pulmonary interstitial fibrosis)是以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征的疾病，根據(jù)病因一般分為特發(fā)性和繼發(fā)性兩類。彌漫性肺間質(zhì)纖維化是由多種原因引起的肺間質(zhì)的炎癥性疾病，病變主要累及肺間質(zhì)，也可累及肺泡上皮細(xì)胞及肺血管。病因有的明確，有的未明。明確的病因有吸入無(wú)機(jī)粉塵如石棉、煤；有機(jī)粉塵如霉草塵、棉塵；氣體如煙塵、二氧化硫等；病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)感染；藥物影響及放射性損傷。因此，建立穩(wěn)定而可靠的肺間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型是探索其發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)有效治療藥物的重要保障。目前，肺纖維化動(dòng)物模型所采用的動(dòng)物主要是嚙齒類動(dòng)物，如小鼠、大鼠、地鼠、家兔等，也有選用較大體型的犬、貓、羊、豬等。
部分造模方法
使用動(dòng)物：大鼠、小鼠、山羊
【造模機(jī)制】：
博來(lái)霉素(bleomycin)是一種多肽類抗腫瘤藥物，其導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化的機(jī)制主要是通過(guò)活性氧的作用。在博來(lái)霉素致肺損傷的早期， 即肺泡炎階段，產(chǎn)生大量氧自由基，對(duì)肺造成損傷。
【造模方法】：
大鼠：選用體重170~200g的Sprague Dawley大鼠。博來(lái)霉素(30mg/支），用0.9％氯化鈉稀釋成4g/L，氣管內(nèi)滴入博來(lái)霉素溶液0.25~0.3ml (5mg/kg)，可建立肺間質(zhì)纖維化模型。以2％戊巴比妥鈉(40mg/200g，即0.25ml/只）腹腔麻醉大鼠，約3~5分鐘后，大鼠進(jìn)入麻醉遲緩狀態(tài)（如麻醉不深，須用乙醚加強(qiáng)）。麻醉后將其仰臥固定于鼠板，將四肢和頭部固定，剪去頸毛。用聚維碘（碘伏）消毒皮膚， 在無(wú)菌操作下切開(kāi)長(zhǎng)約1cm的頸中切口，逐層分離暴露氣管（若室溫低，須用保溫措施）。用彎尖眼科鉗經(jīng)氣管下方穿過(guò)，輕微抬起氣管，盡量接過(guò)氣管分叉處，抬高鼠板頭端，使與桌面成30°~35°。選擇1個(gè)7號(hào)的注射用針頭，將針頭用砂片磨成弧形使其變得圓鈍。在進(jìn)針前用注射器試通注射針頭，避免堵塞。進(jìn)針時(shí)與水平面成150°，在兩個(gè)環(huán)狀軟骨之間刺入。針孔方向面向術(shù)者，有落空感證明已刺進(jìn)1~1.5cm，約到氣管分叉處停止進(jìn)針后注入博來(lái)霉素。注入博來(lái)霉素0.2ml（約4mg/kg)，再向氣管內(nèi)注入0.2ml的空氣2~3次，使藥物在肺部分布 均勻。以大鼠身體長(zhǎng)軸為中心，正反快速旋轉(zhuǎn)鼠板1~2分鐘?？p合皮膚，局部聚維酮碘消毒（或用青霉素消毒）防止感染，室溫保持在24~25℃，待動(dòng)物自然清醒后置籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。
小鼠：選用體重18~20g的雄性昆明小鼠。氯胺酮(100mg/2ml)腹腔注射(10mg/100g)，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后仰臥，縱行切開(kāi)皮膚，鈍性分離暴露氣管，用4號(hào)針頭刺入氣管，盡量接近氣管分叉處，將0.05ml博來(lái)霉素緩慢滴入（博來(lái)霉素每支8mg，用前以生理鹽水配制成0.2％藥液），立即將動(dòng)物直立旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布，然后縫合皮膚，局部乙醇消毒防止感染。同樣，也可選用雌性BLAB/C小鼠，將小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后固定于操作臺(tái)，以動(dòng)物喉鏡壓下小鼠舌根暴露聲門，霧化器從聲門插入氣管并霧化注入博來(lái)霉素溶液100µl (5mg/kg)。
山羊：選用12~15kg的山羊，3％戊巴比妥鈉麻醉下通過(guò)球囊導(dǎo)管選擇性地向左肺下葉支氣管緩慢滴入博來(lái)霉素1.5~3.0U/kg，滴入液體總量按2~3ml/kg給予，滴注完畢后，將山羊左側(cè)臥位30分鐘，以利于藥物的吸收和均勻分布，復(fù)制成肺間質(zhì)纖維化模型。
【造模特點(diǎn)】：
大鼠模型病理組織學(xué)與病理生理學(xué)改變與人類肺間質(zhì)纖維化相似。其病變?cè)缙诒憩F(xiàn)為滲出性肺泡炎，炎癥細(xì)胞在病變處聚集增多。晚期為肺間質(zhì)纖維化，間質(zhì)細(xì)胞增生，基質(zhì)膠原聚集取代正常的肺組織結(jié)構(gòu)。注入博來(lái)霉素2周時(shí)，可見(jiàn)肺系數(shù)（肺重／體重×100％）、羥脯氨酸含量明顯升高。顯微鏡下可見(jiàn)廣泛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞為主，并有肺泡壁增厚、成纖維細(xì)胞增生等Ⅱ級(jí)肺泡炎表現(xiàn)。第4周可見(jiàn)肺間質(zhì)內(nèi)有大量散在綠染的膠原纖維，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，見(jiàn)有許多纖維細(xì)胞等Ⅲ級(jí)肺間質(zhì)纖維化病變。
小鼠使用博來(lái)霉素后15天，病變彌漫，但以肺泡間隔、血管和小氣管周圍顯著。病變處肺泡壁增厚，毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺泡腔變小，其中充滿大量的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞。在氣管、血管周圍及近胸膜處出現(xiàn)以中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，呈3級(jí)肺泡炎性改變。30天后病變彌漫，病變處肺泡壁增厚，肺泡間隔增寬。在氣管和血管周圍及近胸膜處肺組織可見(jiàn)以單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，胸膜增厚，并可見(jiàn)較明顯的成纖維細(xì)胞和膠原纖維的增生和集聚。主要呈1級(jí)纖維化改變。
經(jīng)典的復(fù)制肺纖維化小鼠模型方法是氣管內(nèi)滴入博來(lái)霉素溶液。氣管內(nèi)滴入或霧化博來(lái)霉素均能引起明顯的肺組織損傷與肺纖維化改變。單次氣管內(nèi)滴入博來(lái)霉素即可引起明顯的肺纖維化，但病灶分布欠均勻，不能準(zhǔn)確地模擬人類原發(fā)性肺纖維化病變的彌漫性分布。氣管內(nèi)霧化給藥方式能使博來(lái)霉素更均勻地分布于肺內(nèi)，纖維化改變更彌散，更接近人類肺纖維化改變。氣管內(nèi)霧化博來(lái)霉素溶液不需穿刺氣管，減少了動(dòng)物的損傷與痛苦，可作為復(fù)制肺纖維化小鼠模型的優(yōu)選方案。
山羊使用博來(lái)霉素第3~4天，在中央小葉出現(xiàn)斑片影和粗線條。在第1周末，上述區(qū)域變大、融 合，到達(dá)胸膜下區(qū)域。肺泡和間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)到滲出物。第2~3周，主要表現(xiàn)為毛玻璃樣病灶和微細(xì)的放射性線條，位于中央小葉和氣管血管束周圍，沒(méi)有小葉間隔增厚的征象。第4周，顯示了肺間質(zhì)的異常。肺標(biāo)本的大體觀察顯示呈灰色，組織學(xué)檢查了CT顯示的異常區(qū)域，結(jié)果顯示主要病變?cè)跉夤苤車?，肺段以下肺小葉周圍病變分散。1周內(nèi)主要是肺細(xì)胞化生，伴有肺泡壁破壞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，第2周以后，主要是間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞聚集，伴有膠原纖維增加。第3周后，肺泡間隔增厚。
【模型評(píng)估和應(yīng)用】：
目前用于該模型制作的誘導(dǎo)劑很多，如其中以博來(lái)霉素最為常用。博來(lái)霉素氣管內(nèi)一次性注入可復(fù)制出與人類肺間質(zhì)纖維化病理過(guò)程相似的動(dòng)物模型，可全身給藥，也可局部給藥，可一次性給藥或分多次給藥，也可采用微型藥物泵持續(xù)給藥。具體方法如下：①氣管內(nèi)給藥：是目前較為常用的給藥途徑，是一種局部給藥方法，將誘導(dǎo)劑直接注入動(dòng)物氣管，造成肺部的病變，可以是一次性的，也可以是重復(fù)多次的。對(duì)于博來(lái)霉素的水溶液，多采取的是經(jīng)氣管滴注法。該法雖操作簡(jiǎn)單、成本低，但病變范圍較局限，與人類病變的彌漫性分布有差異，因此采用霧化吸入給藥，克服了前者的弊端，使病灶分布均勻彌散。②腹腔內(nèi)給藥：是一種全身給藥的方法，將誘導(dǎo)劑（如博來(lái)霉素）注入動(dòng)物的腹腔內(nèi)，進(jìn)而發(fā)揮致纖維化作用。一般是多次給藥，有每日連續(xù)給藥的，也有間隔幾日給藥的。當(dāng)藥物在體內(nèi)累積達(dá)到一定量時(shí)，即可建立動(dòng)物模型。但與氣管內(nèi)給藥相比，所致病變部位胸膜、支氣管周圍均比較重，而后者所致病變以支氣管周圍明顯，胸膜不明顯，這與人類的肺間質(zhì)纖維化的病變（病變先由胸膜開(kāi)始）不太相符，故認(rèn)為該法優(yōu)于后者。但與后者相比，因所需藥物量過(guò)多，其費(fèi)用也高，使其在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用受到了一定的限制。
本模型為研究肺間質(zhì)纖維化的病因、發(fā)病機(jī)制及防治提供了一種新的實(shí)驗(yàn)研究手段，可以在嚴(yán)格控制各種條件下觀察肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展和疾病轉(zhuǎn)歸以及這些不同改變?cè)诓±硇螒B(tài)學(xué)、分子生物學(xué)以及影像學(xué)上的表現(xiàn)等規(guī)律，提高對(duì)肺間質(zhì)性疾病的認(rèn)識(shí)水平。
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