前言
高脂血癥(hyperlipidemia)是一種全身性疾病，通常是指血中總膽固醇和（或）甘油三酣過高。選擇合適的動(dòng)物模型是研究高脂血癥的關(guān)鍵。一般而言，選用高脂血癥模型的動(dòng)物，應(yīng)該在血漿脂蛋白構(gòu)成、肝臟膽固醇及脂蛋白代謝等方面，與人類代謝特征極為相近。具體表現(xiàn)為：第一，總膽固醇合成噩中由肝臟合成的量越小越好；第二，增加飲食中膽固醇含量不會(huì)引起膽汁酸合成增加、不擴(kuò)充膽固醇代謝池、不抑制低密度脂蛋白受體活性、不完全抑制肝膽固醇的合成；第三，高脂飲食可以誘導(dǎo)高甘油三酣血癥。
由于小鼠的基因修飾技術(shù)已經(jīng)成熟，基于基因修飾動(dòng)物模型在疾病研究中的優(yōu)勢，高膽固醇血癥基因修飾小鼠的廣泛應(yīng)用，大大推進(jìn)了代謝性心血管病的科學(xué)進(jìn)展。然而，小鼠和人類在脂代謝方面有巨大的差異，例如血漿脂蛋白譜不同、對(duì)食物反應(yīng)性不同、代謝酶表達(dá)不同、甘油三酣代謝不同對(duì)降脂藥反應(yīng)不同等。隨著研究的深入和擴(kuò)展，急需尋找開發(fā)與人類脂代謝更為接近的動(dòng)物。從成 本、繁殖速度、實(shí)驗(yàn)操作、與人類相似性、基因修飾技術(shù)、倫理學(xué)等方面綜合分析，金黃地鼠、家兔、小型豬是適合用于高脂血癥及其并發(fā)癥研究的動(dòng)物。表5-1總結(jié)了幾種常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脂代謝及代謝性心血管病的特點(diǎn)。
部分造模方法
使用動(dòng)物：小鼠、家兔、小型豬
【造模機(jī)制】：
高脂血癥已經(jīng)是被廣泛認(rèn)知的疾病之一，由于脂質(zhì)在血漿中是以脂蛋白的形式存在，因此高脂血癥實(shí)際上是某種高脂蛋白血癥。脂質(zhì)的代謝也是以脂蛋白的形式為主，特別是脂蛋白對(duì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)所起的作用，在代謝中扮演了重要角色。
圖5-2總結(jié)了人類基本的脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程，乳糜微粒(chylomicron,CM)、VLDL、LDL、HDL以及乳糜微粒殘?bào)w(CM remnants)和極低密度脂蛋白殘?bào)w(VLDL remnants)有著復(fù)雜的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)運(yùn)過程，許多重要的酶、受體和載脂蛋白等參與其中。膽固醇為主的脂蛋白主要是LDL,VLDL和HDL,甘油三酯為主的脂蛋白主要是乳糜微粒和VLDL。CETP將膽固醇酯(cholesteryl ester, CE)從HDL轉(zhuǎn)運(yùn)到LDL、VLDL、IDL，而這些脂蛋白中的甘油三酯則向HDL轉(zhuǎn)運(yùn)。LCAT則使游離膽固醇酯化促進(jìn)膽固醇向HDL的轉(zhuǎn)運(yùn)。
與脂蛋白代謝相關(guān)的基因，包括酶、載脂蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，過表達(dá)或缺陷就會(huì)表現(xiàn)高脂血癥?，F(xiàn)在大多數(shù)動(dòng)物模型都是以清除障礙為特征的高脂血癥模型，其中機(jī)制涉及脂蛋白攝取清除的脂蛋白受體以及配體、脂質(zhì)水解的酶以及激活物和抑制物。例如：LDL途徑相關(guān)的載脂蛋白ApoB 100、ApoE,LDLr和抑制物PCSK9,LDL吸收相關(guān)的NPC1L1；HDL途徑相關(guān)的載脂蛋白ApoA-Ⅰ、ApoA-Ⅱ，受體SRBl、SRA、ABCAl，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的CETP、LCAT等；甘油三酯途徑相關(guān)的水解酶LPL及其輔助蛋白GPIHBPl,L Fl；載脂蛋白ApoC-3、ApoA-Ⅴ、ApoA-Ⅳ、ApoC-2等。
圖5-2 脂質(zhì)代謝示意圖
【模型特點(diǎn)】：
1.高膽固醇血癥模型 高膽固醇血癥的基因修飾模型是脂代謝疾病模式動(dòng)物中應(yīng)用最廣泛的模型，為膽固醇代謝機(jī)制、動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制、降膽固醇藥物研發(fā)等方面的研究作出了巨大的貢獻(xiàn)，包括小鼠、家兔和小型豬等動(dòng)物模型。
⑴ ApoE-/-小鼠和LDLr-/-小鼠膽固醇通過LDLr介導(dǎo)途徑被肝臟等攝取的代謝過程稱為LDLr途徑。不論是LDLr，還是作為配體的ApoE的缺陷，均可導(dǎo)致高膽固醇血癥。ApoE-/-小鼠血漿膽固醇水平上升3~5倍，達(dá)到300~500mgdl左右，血漿脂蛋白VLDL和LDL組分顯著升高，HDL降低。與ApoE-/-小鼠相比，LDLr-/-小鼠血漿膽固醇水平只升高2倍，集中于LDL組分。當(dāng)給予高脂飲食，LDLr-/-小鼠血漿膽固醇能迅速上升，通過高脂飲食配方的調(diào)整，可以人為地調(diào)整血漿膽固醇水平升高5~10倍。國內(nèi)多家單位目前已制備出這兩種基因敲除大鼠。
⑵ ApoB-100轉(zhuǎn)基因小鼠：人ApoB-100轉(zhuǎn)基因小鼠LDL水平顯著升高，血漿總膽固醇水平升高2倍，甘油三酯水平也稍有升高。LDL和甘油三酯比例增高非常顯著是該模型的特點(diǎn)。
⑶ PCSK9轉(zhuǎn)基因小鼠：PCSK9抑制劑的開發(fā)已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，將成為替代專利保護(hù)期即將到期的他汀類藥物的新藥。PCSK9調(diào)控LDLr翻譯后水平降解，抑制LDLr重復(fù)利用，當(dāng)過表達(dá)PCSK9時(shí)，LDLr表達(dá)下降，表現(xiàn)和LDLr敲除類似的表型，該模型實(shí)際上相當(dāng)于LDLr-/-小鼠。
⑷ ApoB轉(zhuǎn)基因兔：過表達(dá)入ApoB-100轉(zhuǎn)基因兔，不表達(dá)ApoB-48，血漿中膽固醇和甘油三酯的含量為對(duì)照組的2~3倍，HDL膽固醇則顯著降低。增高的膽固醇和甘油三酯主要為LDL組分。
⑸ PCSK9轉(zhuǎn)基因小型豬：過表達(dá)人功能增強(qiáng)型突變體D374Y-PCSK9的小型豬，普飼條件下表現(xiàn)輕度的高膽固醇血癥。而給予高脂飲食誘導(dǎo)，像小鼠模型一樣，表現(xiàn)嚴(yán)重的高膽固醇血癥，可以比野生型對(duì)照組高5倍以上，雖然對(duì)照組也有高膽固醇血癥。特別值得注意的是，這個(gè)模型發(fā)生冠狀動(dòng)脈的粥樣硬化斑塊，這在小鼠模型上是觀察不到的。
2.高甘油三酯血癥模型
⑴ ApoC-Ⅲ轉(zhuǎn)基因模型：ApoC-Ⅲ的主要生理功能是抑制LPL活性和肝臟脂蛋白受體攝取CM殘粒和VLDL殘?bào)w。ApoC-Ⅲ轉(zhuǎn)基因模型是已經(jīng)報(bào)道的為數(shù)不多的高甘油三酯血癥模型之一。ApoC-Ⅲ轉(zhuǎn)基因小鼠血漿甘油三酯水平隨不同的建模者而不同，有的在300~500mg/dl左右，有的高達(dá)1000mg/dl以上，膽固醇水平隨甘油三酯水平小幅增高。該模型氧化應(yīng)激水平升高是較突出的特征，其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化易感性增高。ApoC-Ⅲ轉(zhuǎn)基因家兔和轉(zhuǎn)基因小型豬也都由北京大學(xué)心血管研究所報(bào)道，均有高甘油三酯血癥的表型，然而升高幅度不大，是非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的2~3倍。ApoC-Ⅲ轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的血漿脂蛋白均為VLDL組分增多，HDL降低。
⑵ ApoC-Ⅱ轉(zhuǎn)基因小鼠：ApoC-Ⅱ的作用是激活LPL活性，然而ApoC-Ⅱ轉(zhuǎn)基因小鼠卻有高甘油三酯血癥的表型。過表達(dá)人ApoC-Ⅱ基因后，小鼠的禁食血漿甘油三酯水平升高4倍，餐后甘油三酯水平升高7倍。但是目前還沒有該模型應(yīng)用的報(bào)道，也沒有敲除小鼠應(yīng)用的報(bào)道。ApoC-Ⅰ轉(zhuǎn)基因小鼠也被報(bào)道有嚴(yán)重高甘油三酯血癥。
⑶ LPL基因敲除(LPL-/-)小鼠：LPL是血漿甘油三酯降解的限速酶，該基因敲除導(dǎo)致新生小鼠致死，原因可能和低血糖及肺功能不全有關(guān)。北京大學(xué)心血管研究所通過人LPL有益突變體腺病毒對(duì)新生小鼠進(jìn)行救治，得到了嚴(yán)重高甘油三酯血癥表型的LPL-/-小鼠。該模型為嚴(yán)重的乳糜微粒血癥，血漿呈牛奶樣外觀。在這個(gè)模型上首次從實(shí)驗(yàn)角度證實(shí)了甘油三酯和動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系。這個(gè)模型還有增高的急性胰腺炎易感性和出現(xiàn)自發(fā)性胰腺炎。ApoE和LPL雙敲小鼠模型是一個(gè)混合型高脂血癥模型。
⑷ GPIHBPl基因敲除( GPIHBP1-/-）小鼠：GPIHBP1是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的蛋白，它錨定在內(nèi)皮細(xì)胞上，鏈接LPL和乳糜微粒，為LPL降解 乳糜微粒中的甘油三酯提供一個(gè)橋梁作用。GPIHBP1-/-小鼠表現(xiàn)類似 LPL-/-小鼠的表型，有嚴(yán)重乳糜微粒血癥。與LPL-/-不同的是，該基因敲除不具有致死性，血漿甘油三酯水平在8周前不能達(dá)到1000mg/dl。 該基因敲除大鼠國內(nèi)也已獲得。
⑸ ApoA-V基因敲除(ApoA-V-/-）小鼠：ApoA-V參與甘油三酯的清除，在人類流行病學(xué)調(diào)查中已經(jīng)明確，ApoA-V-/-小鼠呈高甘油三酯血癥，血漿甘油三酯水平升高4倍左右，但其清除甘油三酯的機(jī)制還不清楚。
此外，ABCG5/8雙敲除小鼠，LCAT、ABCA1、ApoD、CD36、caveolin-1敲除小鼠，ApoA-Ⅱ、SREBP1-c轉(zhuǎn)基因小鼠、PLA2轉(zhuǎn)基因小型豬也都表現(xiàn)輕度的高甘油三酯血癥，大多伴有胰島素抵抗。
【模型來源】：
大多數(shù)小鼠模型可以從美國Jackson實(shí)驗(yàn)室(http://www.jax.org/index.html)、MMRRC (Mutant Mouse Regional Resource Cenlers,http:// www.mmrrc.org)和國家遺傳工程小鼠資源庫(http: //www.nrcmm.cn/mice/index.asp)獲得。大多數(shù)家兔模型可以從日本山梨大學(xué)獲得。高甘油三酯血癥動(dòng)物模型可以從北京大學(xué)心血管研究所獲得。
【模型評(píng)估和應(yīng)用】：
高甘油三酯血癥的病理生理比高膽固醇血癥復(fù)雜，富含甘油三酯脂蛋白比LDL的生物學(xué)效應(yīng)弱，基因修飾模型要表現(xiàn)嚴(yán)重的高甘油三酯血癥才有應(yīng)用價(jià)值。由于臨床對(duì)高甘油三酯血癥不如高膽固醇血癥重視，高甘油三酯血癥模型出現(xiàn)也較晚，因此高甘油三酯血癥和心血管疾病關(guān)系至今不是很清楚，而且也沒有像他汀這樣的特效藥。然而，與西方國家不同，我國是一個(gè)高甘油三酯血癥大國，據(jù)前幾年衛(wèi)生部公布的統(tǒng)計(jì)資料顯示當(dāng)時(shí)我國高甘油三酯血癥患者已經(jīng)達(dá)到1億多，大大超過高膽固醇血癥患者。因此，未來代謝性心血管疾病的研究將進(jìn)入甘油三酯的舞臺(tái)，高甘油三酯血癥的模式動(dòng)物將發(fā)揮重要作用。
目前，基因修飾小鼠在高脂血癥研究中應(yīng)用非 常廣泛，ApoE-/-和LDLr-/-小鼠幾乎成為研究高脂血癥等心血管相關(guān)代謝疾病的工具小鼠，是基因修飾動(dòng)物模型中使用最多的模型。但由于小鼠的脂代謝和人類差異大，故在研究中局限性很大。隨著基因修飾技術(shù)的發(fā)展，家兔和小型豬已經(jīng)報(bào)道了多種脂代謝模式動(dòng)物，由于它們?cè)谥x方面和人類更加接近，所以在機(jī)制研究和新藥開發(fā)方面，比小鼠更有應(yīng)用價(jià)值。圖5-3總結(jié)了應(yīng)用于脂代謝動(dòng)物模型的血漿脂質(zhì)譜，與人類血漿脂質(zhì)譜相比，可以發(fā)現(xiàn)天然和人類脂蛋白組成類似的動(dòng)物有地鼠、犬、小型豬、非人靈長類。這些動(dòng)物脂代謝特點(diǎn)和模式接近人類，作為脂代謝研究的模式動(dòng)物非常合適，但飼養(yǎng)管理不易，費(fèi)用過高。
圖5-3 各種動(dòng)物血漿脂蛋白譜快速液相色譜(FPLC)分析
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